空间转录组技术在肿瘤研究中具有重要意义，能够揭示肿瘤微环境的空间异质性、细胞间相互作用以及基因表达的空间模式。以下是肿瘤空间转录组研究的完整分析流程：
一、实验设计与样本准备
1. 样本类型选择：肿瘤组织通常采用新鲜冷冻或FFPE样本，需根据研究目的选择合适样本类型
2. 组织切片制备：将组织切片放置在空间转录组芯片(如10X Visium)的捕获区域，切片厚度通常为10-20μm
3. 染色与成像：进行H&E染色或免疫荧光染色，使用显微镜获取组织形态学图像
二、数据生成与预处理
1. mRNA捕获与测序：
组织透化处理后，mRNA被芯片上带有oligo-dT和空间条形码的探针捕获
构建文库后进行高通量测序，获得带有空间位置信息的基因表达数据
2. 原始数据处理：
使用Space Ranger等工具进行数据比对和基因表达定量
质控步骤包括去除低质量reads、比对率检查等
三、核心分析流程
1. 数据预处理与质量控制：
使用SpotClean等工具消除spot间交叉污染
采用Sprod、MIST等方法进行空间数据校正和缺失值填充
2. 细胞类型注释：
整合单细胞转录组数据进行去卷积分析，推断每个spot的细胞组成
常用工具包括SPOTlight、CARD、RCTD等
3. 空间域识别：
基于基因表达和空间位置信息识别具有相似表达模式的空间区域
可识别肿瘤核心区、浸润边缘区等特征区域
4. 差异表达分析：
比较不同空间区域或病理状态的差异表达基因
识别肿瘤特异性表达基因和空间梯度变化基因
5. 细胞间相互作用分析：
基于空间邻近性分析细胞类型间的共定位模式
使用stLearn等工具推断细胞-细胞相互作用热点区域
6. 功能与通路分析：
对差异表达基因进行GO、KEGG等通路富集分析
结合空间信息肿瘤微环境中的功能模块
四、高级分析模块
1. 转录因子调控网络：
使用SCENIC分析空间特异的转录因子活性
识别驱动肿瘤空间异质性的关键调控因子
2. 拟时序与发育轨迹：
应用stLearn等工具重建肿瘤细胞的空间演化路径
分析肿瘤进展过程中的基因表达动态变化
3. 多组学整合分析：
结合基因组、蛋白质组数据(如GeoMx DSP)全面肿瘤微环境
整合单细胞转录组提高分辨率
五、可视化与结果解读
1. 空间基因表达图谱：
使用Loupe Browser等工具可视化基因在组织中的空间分布
叠加组织形态学图像进行综合解读
2. 肿瘤异质性分析：
绘制肿瘤不同区域的特征基因表达谱
肿瘤内部的功能亚克隆结构
3. 临床相关性分析：
将空间特征与患者预后、治疗反应等临床数据关联
发现潜在的生物标志物和治疗靶点
六、前沿技术与发展
1. 超高分辨率技术：
Stereo-seq等技术可达到亚细胞级分辨率
Xenium、VisiumHD等新一代平台提升检测灵敏度
2. 多组学空间分析：
整合空间转录组与代谢组(MALDI)等技术
同时基因表达与代谢特征的空间模式
肿瘤空间转录组研究通过上述流程，能够深入揭示肿瘤的空间组织结构、微环境互作机制和异质性特征，为肿瘤诊断和治疗提供新的见解。
