1. 亚克隆定义与形成机制
定义：肿瘤亚克隆指源于同一祖细胞但具有遗传/表型差异的细胞亚群，其形成受突变积累、选择压力等驱动。
关键机制：
遗传突变：如SNVs、CNVs等基因组变异提供初始遗传多样性。
自然选择：微环境压力（如缺氧）促使优势亚克隆扩张（如癌中CNTN5突变亚克隆）。
表观遗传：DNA甲基化等可沉默抑癌基因（如BRCA1），导致耐药亚克隆产生。
2. 筛选技术方法
单细胞技术：
单细胞RNA测序结合空间转录组学可追踪亚克隆分布。
通过copyKAT等工具从单细胞数据推断拷贝数变异及亚克隆结构。
分子克隆技术：
限制性内切酶处理（如BamHI）、载体构建（如pBR322质粒）用于DN段重组筛选。
现代试剂盒（如TOPO克隆）简化传统亚克隆步骤。
细胞层面筛选：
有限稀释法：将杂交瘤细胞稀释至每孔0.5-10个细胞，通过多次克隆确保单克隆性。
软琼脂法：利用半固体培养基分离克隆，结合荧光成像提高效率（如ClonePix 2系统）。
3. 应用与挑战
研究价值：
肿瘤进化模型（线性/分支进化）及免疫逃逸机制。
指导精准治疗（如靶向侵袭性亚克隆的EVs免疫疗法）。
技术难点：
异质性亚克隆的精准区分需多组学整合。
传统化疗/免疫治疗对亚克隆的靶向效率有限。
4. 实验流程示例（以杂交瘤亚克隆为例）
1. 培养基准备：HT完全培养基（含20%胎牛血清）。
2. 饲养细胞铺板：小鼠腹腔巨噬细胞提供生长支持。
3. 细胞稀释与接种：有限稀释法分装96孔板，培养7-10天后筛选单克隆。
4. 验证与扩增：通过ELISA/Western Blot确认抗体分泌，重复克隆至100%阳性率。
如需进一步分析肿瘤亚克隆功能，可结合克隆形成实验评估增殖/侵袭能力，或利用空间转录组绘制亚克隆分布图谱。
