肿瘤浸润淋巴细胞流式

肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)是肿瘤微环境中存在的特异性杀伤淋巴细胞，主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。流式细胞术作为分析TILs的重要技术手段，能够快速、准确地鉴定TILs的组成特征与功能状态。下面将从样本制备、抗体选择、分析逻辑和应用价值等方面详细介绍TILs的流式分析。

TILs流式分析的样本制备

TILs流式分析的样本制备是整个流程的基础环节，直接影响后续分析结果的可靠性。样本制备主要包括肿瘤组织解离、细胞计数和活性评估等步骤：

1. 肿瘤组织解离：首先需要将手术切除或穿刺获取的肿瘤组织机械解离成小块，然后使用胶原酶、DNase等酶进行消化，将组织进一步分解成单细胞悬液。解离后的悬液需通过40-70μm细胞筛过滤，以去除碎片和细胞团。

2. 细胞计数与活性评估：制备好的单细胞悬液需要使用血细胞计数板或自动化细胞计数仪进行细胞计数。活性评估可采用台盼蓝拒染法或流式细胞术死活染料(如7-AAD、DAPI等)来鉴别活/死细胞。

3. 样本保存：新鲜组织样本应置于生理盐水或PBS中，室温保存时尽量在12小时内处理；若无法及时处理，4℃保存时间最好不要超过48小时。

TILs流式分析的抗体组合选择

流式细胞术分析TILs的关键在于选择合适的抗体组合，以全面评估TILs的组成和功能状态。常用的抗体标记物包括：

1. 通用白细胞标记物：CD45是所有白细胞的共同标记物，可用于识别肿瘤内的白细胞群体。

2. T细胞标记物：

3. B细胞标记物：CD19或B220是常用的B细胞标记物。

4. 髓系细胞标记物：

5. 活化和耗竭标记物：

6. NK细胞标记物：NK1.1或CD49b(DX5)可用于识别自然杀伤(NK)细胞。

TILs流式分析的基本逻辑

流式细胞术分析TILs需要遵循一定的逻辑顺序，以确保数据的准确性和可重复性：

1. 活/死细胞鉴别：首先使用活性染料(如7-AAD)排除分析中的死细胞，提高数据质量。

2. 白细胞识别：对CD45+细胞进行设门以识别肿瘤内的白细胞群体，排除肿瘤细胞和其他非白细胞成分。

3. 谱系识别：

4. T细胞亚群分析：

5. 活化/耗竭状态评估：

6. 髓系亚群分析：

TILs流式分析的应用价值

TILs的流式分析在肿瘤研究和临床实践中具有多方面的重要应用：

1. 肿瘤免疫微环境评估：通过分析TILs的组成和功能状态，可以评估肿瘤免疫微环境的特征，如炎症性或非炎症性状态。

2. 预后预测：较高程度的肿瘤浸润淋巴细胞通常意味着较好的肿瘤预后。例如在黑色素瘤中，根据淋巴细胞浸润的分布和强度可分为快速淋巴细胞浸润、非快速淋巴细胞浸润和无淋巴细胞浸润三种类型，对应不同的预后。

3. 免疫治疗指导：

4. 治疗反应监测：肿瘤患者治疗前常有T淋巴细胞、自然杀伤细胞减低、B淋巴细胞增高，化疗后T淋巴细胞可增高，但自然杀伤细胞进一步减低，B淋巴细胞进一步增高。流式细胞术能够准确、快速的检测这些变化。

TILs流式分析的技术进展

随着技术的发展，TILs流式分析的方法不断优化和创新：

1. 自动化分选系统：如德国美天旎生物技术提供的自动化完整TIL细胞分选工作流程，可从小鼠肿瘤组织中高效分离单细胞悬液、磁珠预富集CD45+ TIL细胞，然后从同一样品中依次分选高纯度和高活性的TIL细胞亚群。

2. 多参数分析技术：现代流式细胞仪可实现多参数(20色以上)同时分析，更全面地TILs的异质性。

3. 3D模型分析：使用iQue高通量流式细胞仪平台对3D肿瘤模型中的TILs进行体外分析，更接近体内实际情况。

4. 数据整合分析：集成式iQue Forecyt软件可实现实时采集和分析数据，加快可执行结果的生成速度。

肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析是研究肿瘤免疫微环境和指导免疫治疗的重要工具。通过合理的样本制备、抗体组合选择和分析逻辑，可以全面评估TILs的组成特征和功能状态。随着技术的进步，TILs流式分析在肿瘤预后预测、免疫治疗指导和治疗反应监测等方面发挥着越来越重要的作用。未来，随着多参数分析技术和自动化分选系统的发展，TILs流式分析将为肿瘤免疫治疗提供更加精准的指导。